به منظور کسب بهترین بازده استخراج برخی عوامل تاثیرگذار از قبیل نوع فاز پخش‌کننده، حجم فاز پخش کننده، نوع فاز استخراج کننده، حجم فاز استخراج کننده، زمان استخراج و … بررسی و بهینه شدند. روند انجام این بررسی‌ها در ادامه این فصل بیان گردیده است.

۳-۳-۱- بررسی اثر نوع فاز پخش‌کننده

برای پیدا کردن حلال پخش کننده مناسب که قدرت پخش کنندگی بیشتر و راندمان استخراج بالاتری داشته باشد، آزمایشات مشابهی تنها با تغییر نوع حلال پخش‌کننده ترتیب داده شد. برای این منظور حجم کلروبنزن را Lμ ۱۰ میکرولیتر و حجم انیدرید استیک را Lμ ۵۰ ثابت گرفته، نوع حلال پخش‌کننده، تغییر داده شد. ابتدا در یک بالن ژوژه ۵ میلی‌لیتری استون ریخته، Lμ ۱۰۰ کلروبنزن و Lμ ۵۰۰ انیدرید استیک به آن اضافه و با استون به حجم رسانده شد. سپس mL 5/0 مخلوط استون، کلروبنزن و انیدرید استیک را به محلول آبی شامل mL 5 آب مقطر، mL 5/0 کربنات پتاسیم w/v 5% و Lμ ۵ استاندارد، اضافه گردید. در این مرحله ظرف نمونه به مدت min 2 و با دور rpm 5000 سانتریفوژ قرار داده شد. با بهره گرفتن از یک سرنگ یک میکرولیتری، Lμ ۵/۰ میکرولیتر از فاز ته‌نشین شده، به دستگاه GC تزریق شد (برای بررسی تکرار پذیری، عملیات استخراج ۳ بار تکرار شده است).

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

مشابه همین مراحل برای بررسی میزان تاثیر استونیتریل و متانول به عنوان حلال پخش کننده بر راندمان استخراج انجام گردید. نتایج در بخش ‏۰ بررسی شده است.

۳-۳-۲-بررسی اثر حجم فاز پخش‌کننده

برای بررسی تأثیر حجم استون بر راندمان استخراج، آزمایشات به گونه‌ای انجام شدند که حجم فاز ته نشینی ثابت بماند. چون با افزایش حجم استون، حجم فاز ته نشین شده کاهش می‌یابد برای جبران آن حجم فاز استخراج کننده نیز افزایش داده شد. بدین منظور، حجم‌های مختلفی از محلول استون حاوی کلروبنزن و انیدرید استیک تهیه گردید.
حجم ۲۵/۰ میلی‌لیتر استون حاوی Lμ ۵/۹ کلروبنزن و Lμ ۵ انیدرید استیک، mL 5/0 استون حاوی Lμ ۱۰ کلروبنزن و Lμ ۵۰ انیدرید استیک، mL 1 استون حاوی Lμ ۱۳ کلروبنزن و Lμ ۵۰ انیدرید استیک، mL 5/1 استون حاوی Lμ ۵/۱۶ کلروبنزن و Lμ ۵۰ انیدرید استیک و mL 2 استون حاوی Lμ ۸/۲۲ کلروبنزن و Lμ ۵۰ انیدرید استیک توسط سرنگ‌های ۱ و ۲ میلی‌لیتری به mL 5 آب مقطر حاوی mL 5/0 کربنات پتاسیم ۵% و Lμ ۵ ایزوپرنالین به غلظت ppm 100 تزریق و به مدت min 2 و با دور rpm 5000 سانتریفوژشدند. سپس توسط سرنگ یک میکرولیتری حجم Lμ ۵/۰ از فاز ته‌نشین شده برداشته و به GC تزریق گردید.
حجم فازهای آلی ته نشین شده هم توسط سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. نتایج در بخش ‏۰ گزارش شده است.

۳-۳-۳- بررسی اثر نوع فاز استخراج‌کننده

در این قسمت از مطالعه دو حلال دی‌سولفید کربن و کلروبنزن به عنوان فازهای استخراج کننده مورد آزمایش قرار گرفتند. برای این منظور mL 5/0 استون حاوی Lμ ۱۰ کلروبنزن (به عنوان حلال استخراج کننده) و Lμ ۵۰ انیدرید استیک (به عنوان واکنش‌گر مشتق‌ساز) به mL 5 آب مقطر حاوی، mL 5/0 کربنات پتاسیم ۵% و Lμ ۵ ایزوپرنالین به غلظت ppm 100 تزریق و به مدت min 2 و با دور rpm 5000 سانتریفوژشد. در نوبت بعد mL 5/0 استون حاوی Lμ ۵/۱۸ دی‌سولفید کربن (به عنوان حلال استخراج کننده) و Lμ ۵۰ انیدرید استیک (به عنوان واکنش‌گر مشتق‌ساز) به mL 5 آب مقطر حاوی، mL 5/0 کربنات پتاسیم ۵% و Lμ ۵ ایزوپرنالین به غلظت ppm 100تزریق و به مدت min 2 و با دور rpm 5000 سانتریفوژشد.
حجم فازهای آلی ته نشین شده هم توسط سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. برای بررسی تکرارپذیری، عملیات استخرا ج با هر فاز استخراج کننده ۳ بار تکرار شد. نتایج در بخش ‏۰ گزارش شده است.
تغییر در حجم فازهای استخراج کننده به منظور حصول حجمهای ثابت در حدود ۵ میکرولیتر از فاز ته­نشین شده انجام شده است.

۳-۳-۴-بررسی اثر حجم فاز استخراج کننده

به منظور بهینه‌سازی حجم فاز استخراج کننده، تمامی شرایط استخراج ثابت گرفته شده و فقط حجم کلروبنزن تغییر داده شد. بدین ترتیب که mL 5/0 استون، به ترتیب حاوی ۱۰، ۱۵، ۲۰، ۲۵ و Lμ ۳۰ کلروبنزن و Lμ ۵۰ انیدرید استیک به پنج نمونه آب (mL 5 آب حاوی mL 5/0 کربنات پتاسیم و ایزوپرنالین به غلظت ppm 100) تزریق کرده و پس از سانتریفوژ مطابق مراحل گفته شده قبلی، فازهای ته‌نشین شده به دستگاه GC تزریق و آنالیز شدند.
حجم فازهای ته‌نشین شده به وسیله سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. نتایج در بخش ‏۰ ارائه شده است.

۳-۳-۵- بررسی اثر مشتق‌سازی قبل و در حین استخراج

برای بررسی این اثر، دو سری آزمایش درنظر گرفته شد. در تست اول، mL 5/0 استون حاوی Lμ ۱۰ کلروبنزن را به نمونه آب (mL 5 آب حاوی Lμ ۵۰ انیدرید استیک، mL 5/0 کربنات پتاسیم و ایزوپرنالین به غلظت ppm 100)، که از قبل واکنشگر مشتق‌ساز به آن اضافه شده، تزریق گردید. در این آزمایش فرایند مشتق‌سازی قبل از استخراج انجام گرفت.
در تست دوم، mL 5/0 استون حاوی Lμ ۱۰ کلروبنزن و Lμ ۵۰ انیدرید استیک به نمونه آب (mL 5 آب حاوی mL 5/0 کربنات پتاسیم و ایزوپرنالین به غلظت ppm 100) اضفه شد. در این آزمایش استخراج و مشتق‌سازی به طور همزمان صورت گرفت.
در هر دو تست، پس از سانتریفوژ، فازهای ته‌نشین شده توسط دستگاه GC آنالیز شدند. حجم فاز ته‌نشین شده توسط سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. نتایج در بخش ‏۰ ارائه شده است.

۳-۳-۶- بررسی اثر زمان استخراج و مشتق‌سازی

زمان استخراج و مشتق‌سازی، به مدت زمانی اطلاق می‌شود که نمونه در فاصله زمانی بین تزریق (مخلوط فازهای استخراج کننده، واکنشگر مشتق‌ساز و فاز پخش کننده) و قرار گرفتن در سانتریفوژ، کدر بماند. برای بررسی اثر زمان برروی کارایی استخراج و مشتق سازی نیز، آزمایشات مشابهی همانند بخش ‏۰ انجام گرفت. تنها پارامتری که در این آزمایش‌ها تغییر داده شد زمان استخراج بود که زمان‌های ۰، ۵، ۱۰، ۲۰، ۳۰ و ۶۰ دقیقه در نظر گرفته شدند.
حجم فاز ته‌نشین شده توسط سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. نتایج در بخش۳-۱-۶- ارائه شده است.

۳-۳-۷- بررسی اثر حجم واکنشگر مشتق‌ساز

به منظور بهینه‌سازی حجم واکنشگر مشتق‌ساز، تمامی شرایط استخراج ثابت گرفته شده و فقط حجم انیدرید استیک تغییر داده شد. بدین ترتیب که mL 5/0 استون، به ترتیب حاوی ۰، ۱۰، ۳۰، ۷۰ و ۹۰ میکرولیتر انیدرید استیک و Lμ ۱۰ کلروبنزن به شش نمونه آب (mL 5 آب حاوی mL 5/0 کربنات پتاسیم و ایزوپرنالین به غلظت ppm 100) تزریق کرده و پس از سانتریفوژ، فازهای ته­نشین شده توسط دستگاه GC آنالیز شدند. حجم فازهای ته‌نشین شده به وسیله سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. نتایج در بخش ۳-۳-۷ ‎۰ ارائه شده است.

۳-۳-۸- بررسی اثر درصد کربنات پتاسیم

برای مشتق‌سازی ایزوپرنالین، محیط باید قلیایی باشد. به این منظور از کربنات پتاسیم استفاده شد. برای بهینه‌سازی درصد کربنات پتاسیم K₂CO₃، همه پارامترها را ثابت در نظر گرفته و تنها درصد کربنات پتاسیم تغییر داده شد. به این صورت که mL 5/0 استون، حاوی Lμ ۵ انیدرید استیک و Lμ ۱۰ کلروبنزن به شش نمونه آب (mL 5 آب حاوی mL 5/0 کربنات پتاسیم و ایزوپرنالین به غلظت ppm 100) که در آنها درصد کربنات پتاسیم به ترتیب ۵/۲، ۵، ۵/۷، ۱۰، ۵/۱۲ و ۱۵ می‌باشد، تزریق شد. پس از سانتریفوژ، فازهای ته­نشین شده توسط دستگاه GC آنالیز شدند. حجم فازهای ته‌نشین شده به وسیله سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. نتایج در بخش۳-۳-۸- ارائه شده است.

۳-۳-۹- بررسی اثر افزایش نمک

به منظور بررسی اثر نمک بر روی کارایی استخراج نیز آزمایش‌های مشابهی در نظر گرفته شد. در هر آزمایش به محلول تهیه شده مورد آزمایش مقادیر مشخصی نمک افزوده شد. بدین ترتیب که به پنج نمونه آب (mL 5 آب حاوی mL 5/0 کربنات پتاسیم و ایزوپرنالین به غلظت ppm 100) به ترتیب ۵/۰، ۱/۰، ۱۵/۰، ۲/۰ و ۲۵/۰ گرم سدیم کلرید اضافه شد. سپس mL 5/0 استون، حاوی Lμ ۵۰ انیدرید استیک و Lμ ۱۰ کلروبنزن به نمونه‌های فوق تزریق شدند. پس از سانتریفوژ، فازهای ته‌نشین شده توسط دستگاه GC آنالیز شدند. حجم فازهای ته‌نشین شده به وسیله سرنگ ۱۰ میکرولیتری اندازه‌گیری شدند. نتایج در بخش ‎۰ ارائه شده است.

۳-۳-۱۰- بررسی تکرار پذیری میکرو استخراج مایع- مایع پخشی

تعداد ۷ محلول را به روشی که در بخش ‏۰ گفته شد، تهیه کرده و Lμ ۵/۰ از فاز ته‌نشین شده به دستگاه GC تزریق می‌شود. باید توجه داشت که در هر ۷ بار استخراج، تمامی شرایط کاملاً یکسان باشند. نتایج در بخش۳-۳-۱۰ ارائه گردیده است.

۳-۳-۱۱- محاسبه راندمان استخراج و فاکتور تغلیظ

برای محاسبه راندمان استخراج و فاکتور تغلیظ، از استخراج معمولی استفاده شد. در یک لوله آزمایش mL 2 محلول کربنات پتاسیم w/v 5% ریخته و Lμ ۲۰ از محلول ایزوپرنالین ppm 100 به آن اضافه گردید. سپس Lμ ۱۰۰ انیدرید استیک به آن اضافه کرده و مخلوط حاصل به هم زده شد. بعد از چند دقیقه، mL 2 هگزان نیز به آن اضافه کرده و به مدت min 5 به شدت به هم زده شد تا استخراج معمولی انجام شود. پس از جدایی فازها، Lμ ۵ فاز آلی به دستگاه تزریق گردید. نتایج در بخش۳-۳-۱۱ ارائه شده است.

۳-۳-۱۲-تهیه منحنی کالیبراسیون در استخراج مایع- مایع پخشی

جهت تهیه منحنی کالیبراسیون، ۸ سری محلول استاندارد ایزوپرنالین با در محدوده‌ی غلظتی ۲۰۰ - ۵/۰ میکروگرم بر لیتر به حجم mL 5 با بهره گرفتن از آب مقطر تهیه و به کلیه محلول‌ها Lμ ۵ محلول اپی‌نفرین با غلظت ppm 1 به عنوان استاندارد داخلی اضافه گردید (غلظت استاندارد داخلی در همه محلول‌ها ppm 1 می‌باشد). سپس mL 5/0 کربنات کلسیم ۵% به همه محلول‌ها اضافه می‌شود. سپس mL 5/0 استون، حاوی Lμ ۵۰ انیدرید استیک و Lμ ۱۰ کلروبنزن به محلول ها تزریق می شود. پس از min 2 سانتریفوژ با سرعت rpm 5000، Lμ ۵/۰ از فاز ته‌نشین شده به GC تزریق می‌شود. نتایج در بخش ۳-۳-۱۲ ‏۰ ارائه شده است.

۳-۴- آنالیز نمونه‌های حقیقی

برای بررسی کارآیی روش در آنالیز نمونه‌های حقیقی نمونه‌ی ادرار یک بیمار جمع آوری شده بود، استخراج و آنالیز صورت گرفت. برای این کار دو سری آزمایش ترتیب داده شد.
محلول استاندارد استوکس ازmgL^-1 ۱۰۰۰ برای ایزوپرنالین تهیه و در فریزی با دمایC◦ ۲۰ − نگه‌داری شدند. محلول‌های کاری توسط رقیق‌سازی مناسب و محلول‌ استوکس به‌دست آمدند.
نمونه ادرار شاهد (بدون دارو) از یک داوطلب سالم جمع‌ آوری و نمونه ادرار حقیقی از بیمارستان مصطفی­خمینی­ایلام تهیه و تا زمان استفاده در دمای C◦ ۲۰ − نگه‌داری شدند.
آماده‌سازی نمونه حقیقی- نمونه ادرار شاهد (بدون دارو) از داوطلب سالم در آزمایشگاه تهیه شد، که هیچ‌گونه دارویی حداقل برای ۶ ماه مصرف نکرده بود. نمونه‌های ادرار قبل از آنالیز، در فریزر در دمای C° ۲۰- نگه‌داری شدند. یخ نمونه‌های ادرار منجمد در دمای اتاق باز شد و به مدت min 10 با دور rpm 5000 سانتریفوژ شدند. جسم چربی سفیدی در ته لوله‌ی آزمایش مخروطی ته نشین گردید، احتمالا به سبب هم‌رسوب ماتریکس (از جمله کربامید اسید و اوریک اسید) در ادرار می‌باشد. محلول شناور روی رسوب به درون لوله‌ی شیشه‌ای تمیزی منتقل و از یک صافی mμ ۴۵ فیلتر شد. حجم mL 2 از این محلول تا mL 5 رقیق (به منظور کاهش اثرات ماتریس) و mL 5/0 پتاسیم کربنات w/v 5% اضافه گردید. محلول حاصله برای فرایند DLLME مورد آزمایش قرار گرفت.
برای DLLME، یک بخش mL 5 از نمونه‌ی ادرار رقیق حاوی μg L^−۱ ۱۰۰ ایزوپرنالین در لوله آزمایش ته مخروطی درب دار mL 10 جا داده و سپس mL 5/0 پتاسیم کربنات (w/v 5%) وL μ۵ استاندارد داخلی، محلول اپی‌نفرین ppm 1 به آنها اضافه شد. سپس mL 5/0 استون، حاوی ۵۰ میکرولیتر انیدرید استیک و ۱۰­­میکرولیتر کلروبنزن، به محلول تزریق گردید که به قطرات ریز پراکنده از کلروبنزن به شکل یک محلول ابری منجر گردید.
در این مرحله، در چند ثانیه، آنالیت­ها به درون قطره­های ریز کلروبنزن، استخراج می­شوند. بعد از سانتریفوژ به مدت min 2 با دور rpm 5000، قطرات ریز حلال استخراج کننده در ته لوله آزمایش مخروطی ته­نشین شدند. پس از سانتریفوژ کردن، فاز ته‌نشین شده به‌طور کامل به درون لوله آزمایش دیگری منتقل شد سپس Lμ ۵/۰ از فاز ته‌نشین شده بهGC تزریق شد.

فصل چهارم

تجزیه و تحلیل داده‌ها

۴-۱- بهینه‌سازی شرایط استخراج

در این کار پروژه که روش انجام آن در فصل قبل گزارش شده است، از تکنیک میکرواستخراج مایع- مایع پخشی و دستگاه کروماتوگرافی گازی به منظور آنالیز ترکیب دارویی اپی‌نفرین استفاده شد. به منظور انتخاب شرایط بهینه اثر پارامترهای مختلفی از جمله نوع فازهای استخراج کننده و پخش کننده، انتخاب حجم بهینه این فازها، حجم مشتق‌ساز و همچنین زمان و نمک بر روی کارایی استخراج بررسی شد. تأثیر این عوامل با بررسی راندمان استخراج و فاکتور تغلیظ مورد ارزیابی قرار گرفتند.
برای محاسبه راندمان استخراج و فاکتور تغلیظ از استخراج مایع- مایع معمولی که آزمایش آن در بخش ۴-۲ شرح داده شده است، استفاده گردید. این آزمایش با درصدهای مختلف از پتاسیم کربنات و حجم‌های مختلف از انیدرید استیک ۴ مرتبه تکرار شد و نتایج کاملاً تکرار پذیر بودند. بنابراین با این فرض که استخراج مایع-مایع معمولی با راندمان نسبتاً کامل انجام شده است، می‌توان غلظت در فاز ته‌نشینی را به دست آورد. چون راندمان کامل است پس غلظت ایزوپرنالین در فاز هگزان برابر همان غلظت اولیه است که به نمونه آبی اضافه شده (حجم فازهای آلی و آبی برابر می‌باشد) و مساحت زیر پیک آنها هم مشخص است. بنابراین با داشتن مساحت زیر پیک ایزوپرنالین در فاز ته‌نشینی می‌توان به سادگی غلظت این ترکیب را در فاز ته‌نشینی با بهره گرفتن از تناسب زیر به دست آورد: