۰.۰۰۷۲۷

۰.۱۲ µM

Na₂MO₄2H₂O

۰.۰۰۵

۰.۰۸ µM

CuSO₄5H₂O

نکته: مقدار نمک های مذکور در جدول فوق برای ۲۵۰ لیتر محلول هوگلند می باشد. بدین منظور مقادیر هر نمک به صورت جداگانه در یک لیتر آب مقطر حل و محلول های مادری به دست آمده در تاریکی و دمای ۴ درجه سانتیگراد قرار داده شد. برای تهیه ۲۰ لیتر محلول هوگلند، از هر محلول پایه‌ی نمک ها مقدار ۴۰ سی سی استفاده گردید.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۲-۲- شرایط گلخانه
به منظور رشد مناسب گیاهان، شرایط محیط گلخانه تنظیم شد. به این منظور، دمای گلخانه در حدود ۲۵ درجه سانتی گراد و شرایط نوری آن به صورت ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی تنظیم گردید.
لازم به ذکر است که برای ورود گیاهان آرابیدوپسیس به فاز زایشی و تولید ساقه گل دهنده در آنها، یک لامپ با نور زرد رنگ به مدت ۳-۲ روز در بالای آنها روشن شد.

شکل ۳-۱- کاشت گیاهان آرابیدوپسیس در سیستم هیدروپونیک
۳-۲-۳- مایه زنی باPss
پس از رسیدن گیاهان آرابیدوپسیس به مرحله رشدی مناسب (۵ هفته پس از رویش) اقدام به مایه زنی گردید. از کشت ۲۴ ساعته باکتری Pss روی محیط پایه NA سوسپانسیونی به غلظتcfu.ml^-1 ۱۰^۷در آب مقطر سترون تهیه و با بهره گرفتن از افشانه سرتاسر گیاهان داخل جعبه پاشیده شد. به منظور حفظ رطوبت به مدت ۲۴ ساعت درب جعبه ها به صورت کامل گذاشته شد. در مورد تیمارهای شاهد نیز از آب مقطر سترون برای مایه زنی استفاده شد.
۳-۲-۴- نمونه برداری
نمونه برداری از گیاهان در زمان های صفر، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت پس از مایه زنی انجام گرفت. چه در مورد گیاهانی که در فاز رویشی بودند و چه در مورد گیاهانی که وارد فاز زایشی شده بودند، تمام قسمت ها(shoot) به جز ریشه برداشت گردید. در همه موارد، نمونه برداری از گیاهان سالم و در یک ساعت معین انجام شد. بافت ها بلافاصله و با صرف کمترین زمان ممکن داخل فویل آلومینیومی گذاشته و درون ازت مایع قرار گرفتند و داخل فریزر با دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. همزمان با نمونه گیری از جعبه های مایه زنی شده، از جعبه گیاهان شاهد نیز نمونه گیری صورت گرفت تا دقت آزمایش افزایش یابد.
۳-۳- بررسی میزان جمعیت باکتری Pss
به منظور تعیین جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری، صفر، ۲۴، ۴۸، ۷۲ ساعت و ۸ روز پس از مایه زنی، همزمان با نمونه برداری مقدار ۱/۰ گرم بافت از یک گیاه جداگانه، به صورت تصادفی برداشت و به آزمایشگاه انتقال داده شد. بافت داخل هاون چینی سترون و یک میلی لیتر بافر سولفات منیزیوم ۱۰ میلی مولار اتوکلاو شده (۴/۲ گرم MgSo₄ در یک لیتر آب مقطر) به آن اضافه و کاملا له گردید. سپس از عصاره بدست آمده ۱۰۰ میکرولیتر برداشته و به ۹۰۰ میکرولیتر آب مقطر سترون درون ویال دیگر اضافه و به همین ترتیب چندین سری رقت تهیه گردید. از هر رقت تهیه شده ۱۰۰ میکرولیتر را برداشته و روی پتری های ۸ سانتیمتری حاوی محیط کشت پایه NA ریخته و با بهره گرفتن از میله L شکل کشت داده شد. پس از گذشت ۲۴ ساعت پرگنه های داخل پتری ها شمارش و با بهره گرفتن از فرمول N= X. V. D جمعیت باکتری محاسبه و نتایج آنالیز گردید (نیک نژاد کاظم پور، ۱۳۸۰).
N: جمعیت باکتری
X: تعداد کلنی باکتری در هر پتری
V: میزان رقت تهیه شده از سوسپانسیون
D: حجم سوسپانسیون اصلی
۳-۴- استخراج DNA
برای تهیه DNA گیاه بعنوان نمونه شاهد به منظور استفاده در واکنش PCR و همچنین تست آغازگرهای مربوط به ژن های اصلی و کنترل داخلی مورد استفاده در پژوهش، استخراج DNA از نمونه های شاهد با روش ژانگ و همکاران (۱۹۹۸) صورت گرفت:

• بافر استخراج (CTAB) به مدت ۳۰ دقیقه داخل حمام آب گرم (بن ماری) با دمای ۶۵ درجه سانتیگراد قرار داده شد.

• یک میکرولیتر از محلول ۲- مرکاپتواتانول به ازای هر میلی لیتر بافر استخراج به آن اضافه گردید.

• بافت داخل هاون سترون با ازت مایع کاملا کوبیده و مقدار ۲/.۰گرم از بافت برداشته شد.

• ۷۰۰ میکرولیتر بافر استخراج به آن اضافه و مدت ۳۰ ثانیه ورتکس گردید تا کاملا مخلوط شود.

• به مدت ۳۰ دقیقه در حمام آب گرم با دمای ۶۵ درجه سانتیگراد قرار داده و مرتب وارونه شد.

• ۷۰۰ میکرولیتر محلول کلروفرم- ایزوآمیل الکل (به نسبت ۱:۲۴) به آن اضافه کرده و به مدت ۵ دقیقه تکان داده شد.

• به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه انجام گردید.

• رونشین جدا شده و هم حجم آن ایزوپروپانول سرد اضافه کرده و وارونه شد.

• سانتریفوژ ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۸ دقیقه انجام گردید.

• رونشین حذف و ۵ دقیقه روی دستمال کاغذی در دمای محیط قرار داده شد.

• ۳۰۰ میکرولیتر اتانول ۷۰ درصد به ویال اضافه کرده، وارونه و سپس سانتریفوژ ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۸ دقیقه انجام گردید.

• اتانول حذف و ۱۵ دقیقه روی دستمال کاغذی در دمای محیط قرار داده شد.

• ۵۰ میکرولیتر آب مقطر سترون به آن اضافه شد، ۱۵ دقیقه در دمای محیط قرار داده شد و پس از حل کردن رسوب و انتقال به یک ویال جدید، نمونه ها داخل فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد قرار داده شدند.

۳-۴-۱- طرز تهیه بافر CTA
B