نشانگر^[۱۴۲] مخصوص DNA( 1Kb)
(GeneRuler 1Kb DNA Ladde(,250µg), Thermo SCIENTIFIC(fermentas),cat#:SM0311)
محلول اتیدیوم­بروماید^[۱۴۳](EtBr)g.ml­µ ۵/۰
دستگاه ترانس لامیناتورDarkroom, UVP ,Bioimaging systems) (Epi Chemi ɪɪ
۳-۲-۲-۲-۴-۱-۲- روش کار
پودر آگارز
حل کردنg1 پودر آگارز درml 100 بافرX ) TBE 5/0(از طریق حرارت دادن در مایکروویو به مدّت min5/1-0/1(نباید تکه­های ژلاتینی یا پودر در محلول دیده­شود و محلول باید یک­دست شود).
آماده ­سازی شانه مناسب(با توجه به تعداد نمونه­ها) به فاصله حدوداً mm 1 از کف سینی الکتروفورز(به حدّی که یک ورقه کاغذ از فضای بین شانه و سینی به راحتی عبور کند).
ریختن محلول ژل بعد از کمی خنک شدن،حدود c^◦ ۵۵-۴۵ ( داغ بودن بیش از حد محلول باعث آسیب به سینی ژل می­ شود.) به آرامی در سینی با توجه به میزان مورد نظر نمونه برای بارگزاری.هر چه نمونه بیشتر باشد،قطر چاهک می­بایست بیشتر باشد امّا قطر ژل نباید از ml 5 تجاوز کند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

مخلوط کردن محصولات استخراج با رنگ بافر بارگزاری به نسبت ۵ به ۱و قرار دادن ژل در تانک الکتروفورز وبارگزاری^[۱۴۴] نمونه­ها در چاهک­ها.
بارگزاری نشانگر DNA(1Kb)در یکی از چاهک­ها ترجیحاً چاهک سمت چپ.
تنظیم دستگاه در حالت ولتاژ ثابت v 100 به مدّتmin 60 .
قرار دادن ژل داخل مخزنرنگاتیدیوم­بروماید در اتاق مخصوص اطلاعات ژل^[۱۴۵] به مدّت min15-10 برای رنگ­آمیزی(پس از رسیدن رنگ بافر بارگزاری به یک سوم ژل).
قرار دادن ژل رنگ شده در مخزن آب مقطر جهت پاک کردن رنگ­های اضافی.
قرار دادن ژل روی دستگاه ترانس UV لامیناتوردر معرض نور UVو مشاهده باندهای اختصاصی روی ژل و عکس­برداری توسط دوربین مخصوص.
۳-۲-۲-۲-۴-۲- استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ^[۱۴۶]
این دستگاه با حساسیت و دقّت بالا طول موج نمونه DNA را تنها با نیاز به مقادیر اندک در حد µl 2-1 و بدون نیاز به رقیق­سازی قرائت کرده و در نهایت غلظت نمونه و نسبت جذب نوری ۲۸۰/۲۶۰ را نیز محاسبه می­ کند. در این پروژه غلظت DNA با دستگاه نانودراپ هم سنجیده­شد.مراحل به صورت زیر است:
قرار دادن مقدارµl1آببدونیونجهتاستانداردسازیدردهانهفیبرنوریدستگاه^[۱۴۷] .
پاک کردن دهانه بادستمالیاپنبهاستریل .
قرار دادن µl­۱ ازنمونهاستخراجشده دردهانه فیبرنوری .
محاسبهغلظتوسایرپارامترها .
۳-۲-۳- واکنش PCR کیفی:
۳-۲-۳-۱- هدف از انجام این مرحله
به دلیل حساسیت بالای روش PCRکمی یا همان Real time PCR،تمام عوامل در ابتدا با PCR کیفی تنظیم و راه ­اندازی شد و شرایط بهینه برای فرایند PCR از جمله دمای چسبندگی مناسب برای هر سه آغازگر،غلظت مناسب هر آغازگر،میزان DNA الگوی مورد نیاز و سایر شرایط و عوامل، کاملاً بدست آمد.
۳-۲-۳-۲- مواد و لوازم
اتانول ۷۰%
سمپلر و سرسمپلرµl 100-10 ، lµ۱۰-۱
ویال استریل ml 2/0
آغازگرهای اختصاصی^-۱lµPmol.10 (رفت و برگشت)^[۱۴۸]
مواد PCR
)]dNTP (10mM^[149] ، (mM 50)MgCl₂، (X­۱۰)PCR Buffer ،(۵u.µl^-1)آنزیمDNA پلیمرازTaq
(l^-1­µ .u 5)، آب بدون یون استریلcat#:9201, [
DNA الگو (DNA اسپرم گاو)
دستگاه ایجاد کننده چرخه های دمایی^[۱۵۰](۹۶ Universal Gradient,PeqSTAR,Germany)
ژل آگارز ۲%
نشانگر DNAbp 100
۳-۲-۳-۳- روش کار
۳-۲-۳-۳-۱- طراحی آغازگرهای اختصاصی
در این مطالعه جهت محاسبه نسبت اسپرم­های نرزا(حامل کروموزوم Y ) و ماده­زا(حامل کروموزوم X ) و در واقع تعیین نسبت جنسی در مایع منی ۷ رأس گاو در دو فصل سرد و گرم،۳ جفت آغازگر بر اساس توالی ژنومی موجود برای ژن­های SRY^[151]،PLP ^[۱۵۲]،PAR^[153]( به شماره بانک ژنی به ترتیبEU581861.1 ،AJ009913.1 و AC234910.2 ) با بهره گرفتن از نرم­افزار Oligo7 طراحی گردد.
۳-۲-۳-۳-۲- رقیق­سازی آغازگرها
آغازگرها به صورت خشک شده از طریق انجماد و خلاء خریداری و با توجه به دستورالعمل هر آغازگر مقدار مناسبی آب به آن­ها اضافه شد تا محلول^-۱Pmol.µl 100 ایجاد شد.سپس به محلول l^-1µ.Pmol 10 رقیق شدند تا در فرایند PCR استفاده شوند.
توالی و سایر اطلاعات آغازگرها در جدول(۴-۳) آمده است.
جدول(۳-۴):اطلاعات مربوط به آغازگر­ها