محلول ِD
۵۰ میلی لیتر
۳۵ میلی لیتر
۱۰۴ میلی لیتر
۳۱۱ میلی لیتر
سپس pH محلول روی ۶/۷-۴/۷ تنظیم گردد. ( Waley and North, 1997).
۳-۸-۲- فعالیت لیزوزیم:
فعالیت لیزوزیم سرم بر اساس روشClerton و همکاران (۲۰۰۱) ، Kim وAustin (2006) و بر مبنای لیز باکتری گرم مثبت حساس به آنزیم لیزوزیم یعنی میکروکوکوس لیزودیکتکوس[۱۸] (Sigma, M 3770, St. Louis, USA) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، سرم مورد آزمایش چهار مرتبه با بهره گرفتن از بافر سیترات – فسفات (۱/۰ مولار، pH=5/8) و ضریب رقّت یک دوم رقیق شده و ۱۰۰ میکرولیتر از رقّتهای سرم در چاهکهای میکروپلیت ۹۶ خانهای (ته صاف) ریخته شد. سپس به هر کدام از چاهکها ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده باکتری در همان بافر (µg/ml75) افزوده شده و بلافاصله نمونهها مخلوط شدند. سپس اجازه داده شد این واکنش در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد صورت گیرد. در نهایت جذب نوری[۱۹] نمونهها هر ۳۰ ثانیه یکبار تا ۵/۴ دقیقه به کمک الایزا ریدر در طول موج ۵۳۰ نانومتر قرائت شد و از بافر سیترات – فسفات به عنوان بلانک استفاده شد. همچنین برای کنترل منفی از بافر فوق به جای سرم استفاده گردید. در نهایت طبق تعریف یک واحد فعالیت لیزوزیم عبارت خواهد بود از مقدار سرمی که سبب کاهش جذب نوری به مقدار ۰۰۱/۰ در دقیقه شود.
( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
طرز تهیه بافر سیترات فسفات
ابتدا محلول ذخیره (استوک) فسفات (۱/۰ مولار) با افزودن ۹۰۳/۸ گرم NaHPO4.2H2O به ۵۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه شده، سپس محلول ذخیره سیترات (۱/۰ مولار) با افزودن ۱۰۱۴/۲ گرم اسید سیتریک در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه می شود. در نهایت برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر محلول کاری، ۷۰ میلی لیتر از محلول ذخیره فسفات در یک ظرف استریل ریخته آنقدر محلول ذخیره اسید سیتریک به آن اضافه می شود تا pH محلول روی ۸/۵ تنظیم گردد. سپس به آن ۹۰ میلی گرم NaCl به آن افزوده شده و محلول کاری با بهره گرفتن از فیلتر میلی پور استریل می شود. (تکمه چی. ا، ۱۳۸۶).
۴-۸-۲- اندازه گیری میزان توتال ایمونوگلوبولین(Total immunoglobolin)
برای اندازه گیری این فاکتور ایمنی از روش Bradford protein assay استفاده می شود، و اساس کار در این روش بر مبنای میزان جذب نوری است که محلول Coomassie Brilliant Blue G-250 (به عنوان ماده رنگ پذیر) هنگام اتصال با پروتئین های نمونه در طول موج nm 595 نشان می دهد.
خلاصه روش کار به این ترتیب است که مقدار μlitr100 از سرم نمونه را با ml 5 معرف حاوی Coomassie Brilliant Blue G-250 درون تویوپ مخصوص مخلوط کرده و در طول موج nm 595 میزان جذب نوری آن قرائت شده و با بهره گرفتن از منحنی استاندارد میزان توتال ایمونوگلوبولین محاسبه می شود.
۹-۲- بررسی فاکتورهای خونی
در پایان دوره ۹ ماهی از هر تیمار به طور تصادفی انتخاب شده و پس از بیهوشی در محلول پودر گل میخک اقدام به خونگیری شده و پس از افزودن ماده ضد انعقاد هپارین به آن جهت بررسی فاکتورهای خونی نظیر تعداد گلبول های سفید و قرمز در میکرولیتر خون، هماتوکریت و هموگلوبین مورد استفاده قرار می گیرد.
۱-۹-۲- شمارش تعداد گلبول های سفید در میکرولیتر خون
برای شمارش گلبول های سفید ابتدا خون حاوی ماده ضد انعقاد را به نسبت ۱ به ۲۰۰ با محلول نات-هریک (Nott Herick) (20 میکرولیتر خون حاوی هپارین در ۴ میلی لیتر محلول نات-هریک) رقیق کرده، سپس حجم آن را با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانده می شود و بعد با کاغذ صافی واتمن(Whatman Filter) فیلتر می شود. بوسیله یک پیپت پاستور مقداری از خون رقیق شده و فیلتر شده را برداشته و یک قطره از آن را روی لام هماسیتومتری (نئوبار) قرار داده و در زیر میکروسکوپ نوری با عدسی شیئی ۱۰۰ سلول های سفید در چهار مربع کناری لام شمارش شده و پس از جمع کردن تمام سلول های شمارش شده با بهره گرفتن از رابطه زیر تعداد سلول های سفید در میکرولیتر خون محاسبه می شود(جعفری، ۱۳۸۷).
۴ / ۲۰۰۰ * سلول های سفید شمارش شده در لام نئوبار = تعداد سلول های سفید در هر میکرولیتر خون
جدول ۴-۲- ترکیب محلول نات- هریک (Nott Herick) (براون، ۱۳۷۰):
نام ماده
فرمول شیمیایی
مقدار
نمک
NaCl
۸۸/۳ گرم
فسفات هیدروژن سدیم
Na2HPO4
۷۴/۱ گرم
فسفات هیدروژن پتاسیم
K2HPO4
۲۵/۰ گرم
