انجماد و حفاظت جنین، روشی شناخته شده است که در بسیاری از کلینیک های ناباروری جهان انجام
می گیرد. در بیماران مبتلا به سرطان با بهره گرفتن از IVF می نوان جنین هایی را برای استفاده در آینده ذخیره کرد به شرط آنکه بیمار متاهل باشد و قبل از شروع درمان زمان کافی برای انجام IVF و ذخیره ی جنین داشته باشد. اما از آنجایی که در سیکل های IVF پس از تحریک تخمک گذاری به طور معمول سطح استرادیول به ده برابر میزان استرادیول طبیعی می رسد در بعضی سرطان ها نظیر سرطان سینه این روش پیشنهاد نمی شود.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

به طور کلی انجام و حفاظت جنین یک روش معمول و قابل اجرا در اکثر مراکز IVF است که کارایی بالایی نیز دارد. اما این روش محدودیت هایی نیز دارد که شامل موارد زیر است: هنگامی که به تاخیر انداختن شروع درمان امکان پذیر نباشد و در نتیجه زمانی برای تحریک تخمدان جهت گرفتن تخمک وجود نداشته باشد همچنین در مورد بیمارانی که تحریک تخمدان برایشان مضر است و یا برای کودکان و افراد مجرد این روش امکان پذیر نیست.
از آنجا که روش انجماد جنین در کودکان و زنان مجرد امکان پذیر نیست انجماد اووسیت در این دسته بیماران در صورتیکه زمان کافی قبل از شروع درمان داشته باشند می تواند مفید باشد. بر خلاف انجماد جنین و اسپرم نتایج اولیه در مورد انجماد اووسیت نا امیدکننده بود، بطوریکه میزان حاملگی حاصل از اووسیت فریز شده از ۲۰ درصد تجاوز نمی کند.
در روش های انجماد اووسیت می توان از اووسیت های بالغ یا نابالغ استفاده کرد که نتایج متفاوتی از انجماد آن ها حاصل می شود. میزان حاملگی حاصل از اووسیت های بالغ منجمد شده به مراتب بیشتر اووست های نا بالغ است اما اووسیت های بالغ ویژگی هایی دارند که مانع موفقیت کامل این روش می شود. اندازه بزرگ و حجم زیاد اووسیت آسیب پذیری آن را نسبت به تشکیل کریستال های یخ افزایش می دهد. همچنین از آنجایی که اووسیت های بالغ در متافاز II متوقف شده اند، دوک های تقسیم نازک و شکننده و مستعد دپلیمریزه شدن دردمای پایین هستندو این امر می تواند موجب پراکندگی کروموزومی و آنوپلوییدی شود. با این حال چند مورد حاملگی حاصله از اووسیت منجمد شده گزارش شده است[۱۲۳].
میزان حاملگی حاصل از انجماد اووسیت نابالغ از اووسیت بالغ کمتر است که به مشکلات تکنیکی مربوط می باشد که در طی پروسه ی انجماد و ذوب و بلوغ آزمایشگاهی اووسیت رخ می دهد. بطور کلی انجماد اووسیت یک روش جایگزین برای حفظ باروری بیماران مجرد است و در سال های اخیر متخصصین توانسته اند به پیشرفت های چشم گیری در زمینه آن دست یابند[۵۵].
انجماد شامل فریز کردن و ذخیره سازی سلول ها در نیتروژن مایع در دمای -۱۹۶ºc است.در این دما تمامی فرایندهای متابولیکی متوقف می شوند. فرایندهای فیزیولوژیک و وقایع سلولی در تقسیم سلولی دخیلند نیز بطور برگشت پذیر در اثر انجماد متوقف می شوند. یکی از دلایلی که در دمای -۱۹۶ºc هیچ واکنش شیمیایی رخ نمی دهد این است که در دمای -۱۳۰ºc دیگر آبی در سلول وجود ندارد و آب در واکنش های سلولی و حفظ عملکرد سلول بسیار ضروری است. همچنین در دمای -۱۹۶ºc به علت پایین بودن انرژی گرمایی واکنش شیمیایی رخ نمی دهد[۱۳۰].
۱-۷-۱- مراحل اصلی انجماد

• • تماس بامواد محافظت کننده در برابر انجماد که آسیب سلولی ناشی از تشکیل کریستال یخ را به حداقل برساند.

• • کاهش پیش رونده ی درجه حرارت تا -۱۹۶ºc

• • ذخیره سازی

• • ذوب کردن بعد از مدت زمان های متفاوت

• • رقیق کردن و شستن مواد محافظت کننده به منظور بازگرداندن سلول به محیط فیزیولوژیک اولیه جهت رشد بعدی آن

• • فریز می تواند آسیب هایی را به سلول وارد کند مثل آسیب حاصل از سرمازدگی-تشکیل کریستال یخ و چروکیدگی و پارگی غشا.

۱-۷-۲- راه های کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده

• • استفاده از مواد انجماد دهنده با سمیت کمتر و نفوذ بالا (نظیر اتیلن گلیکول)

• • استفاده از دو ماده انجماد دهنده یا بیشتر که اثرات سمی هر یک کاهش یابد

• • بکار بردن مخلوطی از مواد انجماد دهنده ی نفوذ پذیر و غیر نفوذ پذیر

• • اضافه کردن مواد انجماد دهنده مرحله به مرحله به صورتی که غلظت آن در هر مرحله افزایش یابد.

۱-۷-۳- روش های انجماد
سه روش متفاوت جهت انجماد سلولهای پستانداران وجود دارد: روش متداول انجماد آهسته، سریع و روش انجماد شیشهای. انجماد آهسته و انجماد شیشه ای که تفاوت اصلی این دو روش در سرعت خنک کردن و غلظت مواد انجماد دهنده است. روش های مذکور اهداف مشابهی دارند که شامل حفظ سلول ها از آسیب های ناشی از انجماد نظیر تشکیل یخ درون سلولی و دهیدراته شدن و اثرات سمی انجماد می‏باشد. اگر چه این روشها تفاوتهایی با یکدیگر دارند، لیکن هر کدام میتوانند نتایج موفقیت آمیزی در انجماد سلولهای پستانداران داشته باشند. موفقیت در انجماد به انتخاب روش مطلوبتر برای هر نوع سلول بستگی دارد. توسعهی روش های انجماد تخمک و جنین یک فاکتور اصلی در اصلاح نژاد پستانداران مانند گوسفند، گاو، بز و …. در سراسر جهان است. در این مطالعه اجمالا به تشریح روش انجماد شیشهای اکتفا میکنیم.
۱-۷-۳-۱- انجماد شیشهای
در سال ۱۹۳۷ لویت استفاده از روش انجماد شیشهای را در انجماد بافتها شرح داد[۹۶]. روش انجماد شیشهای شامل استفاده از غلظت بالای ضد یخ (۷-۵ مول) و سرعت خیلی بالای سرد کردن (۲۵۰۰۰-۲۰۰۰ درجه سانتیگراد بر دقیقه) است. رال آورده است که هر آبی در سرعت سرد کردن ۱۰۷ درجه سانتیگراد بر دقیقه میتواند شیشهای شود. سلولها زمانی که در معرض غلظت بالای ضد یخ قرار میگیرند آبگیری میشوند. سلولهای معلق در ضد یخ زمانی که مستقیما در نیتروژن مایع غوطهور میشوند یک محیط شبیه شیشه را تشکیل میدهند. این تکنیک یخ داخل سلولی را کاملا حذف میکند[۱۲۷]. با این وجود سلولها ممکن است در اثر مجاورت با غلظت خیلی بالای ضد یخ آسیب ببینند.
استراتژی انجماد شیشهای حذف کلی تشکیل یخ و سپس تلاش برای کاهش سمیت و تغییرات اسمزی است. روند فیزیکی انجماد شیشهای را میتوان به صورت انجماد سازی شبیه شیشه محلولها در دمای پایین بدون تشکیل یخ تعریف کرد. این پدیده میتواند با افزایش غلظت و یا با افزایش سرعت انجماد و ذوب به دست آید. فاکتورهای دیگر تسهیل کنندهیانجماد شیشهای کاهش حجم محلولها و افزایش فشار هیدروستاتیک میباشند. هر چند مورد آخر اهمیت عملی خیلی کمی در جنین شناسی دارد. در سال ۱۹۹۶ مارتینو و همکاران نشان دادند که در استفاده از سرعت بالای انجماد، تخمک گاو بعد از انجماد شیشهای هنوز توانایی رشد و تکامل تا مرحله بلاستوسیست را دارد [۹۹].
۱-۷-۳-۱-۱- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشهای
زمان تعادل و آبگیری
آبگیری سلولها در انجماد بسیار مهم است. آسیبهای احتمالی سلول اغلب در دمای بین ۱۵ و ۹۰- درجه سانتیگراد رخ میدهند. اگر سلول کاملا آبگیری نشود زمانی که دما به پایینتر از صفر درجه سانتیگراد برسد، یخ داخل سلولی تشکیل میگردد ]۱۳۸[.
زمان مطلوب تعادل و آبگیری وابسته به دما است. نفوذپذیری و سمیت هر دو در دماهای بالا افزایش مییابد ]۱۵۹،۳۲[. به طور کلی در فرایند انجماد شیشهای تماس کوتاه مدت نمونه با محلول انجماد مطلوبتر است و برخلاف انجماد آهسته هر نی انجماد به تنهایی سرد میشود ]۱۵۹[. همچنین زمان تعادل وابسته به خصوصیات نفوذپذیری سلولهای مورد مطالعه است. نفوذپذیری جنین به ضد یخ در طی مراحل تکامل، بهطور قابل ملاحظهای تغییر میکند. نشان داده شده است که میزان حیات مراحل مختلف تکاملی نمونه با محلول یکسان، متفاوت است ]۲۷[. برای اجتناب از سمیت محلول انجماد شیشهای بایستی زمان تعادل جنین با محلول کوتاه باشد. باید توجه داشت اگر این مدت زمان خیلی کوتاه باشد نفوذپذیری ضد یخ کافی نبوده و یخ داخل سلولی تشکیل میشود حتی اگر یخ خارج سلولی وجود نداشته باشد. بنابراین زمان مطلوب تعادل بایستی بهگونهای باشد که از یکطرف مانع آسیب ناشی از اثرات سمی به علت طولانی شدن زمان تعادل و از طرف دیگر مانع تشکیل یخ داخل سلولی شود. همچنین زمان تعادل وابسته به نوع و غلظت محلولی است که مورد استفاده قرار گرفته است. هر چه نفوزپذیری محلول بیشتر باشد زمان لازم برای تعادل کوتاهتر خواهد]۷۴[.
۱-۷-۳-۱-۱-۲-سرعت سرد کردن
سرعت انجماد یکی از معیارهای اصلی بقای سلول در زمان انجماد است. سرعت انجماد خیلی آهسته ممکن است سلولها را بهخاطر مواجهه طولانی مدت با یک محلول غلیظ از بین ببرد. بهعلاوه سرمادهی خیلی آهسته میتواند باعث مرگ سلولی با تشکیل کریستال یخ شود. مازور معتقد است که ارتباط بقای سلول و سرعت انجماد میتواند به صورت منحنی زنگی شکل باشد ] ۱۰۵،۱۰۴،۱۰۳،۱۰۲[. اساسا بقای سلول در سرمادهی با سرعت کم، پایین است، در میزان کمی بالاتر از حد متوسط افزایش مییابد و نهایتا در سرمادهی با سرعت بالا کاهش مییابد. نفوذپذیری ضدیخها نیز با تغییر دما، تغییر مییابد ]۱۰۵[.
زمانی که سلولها در محلولی تا دمای زیر صفر درجه سرد میشوند کریستالهای یخ ابتدا در محلول خارج سلولی شکل گرفته و سیتوپلاسم سلول دچار فرا سرما^[۷۲] میشود. چنانچه سیتوپلاسم سلول تا دمای پایینتر سرد شود (زیر ۱۰- یا ۱۵- درجهسانتیگراد) کریستالهای یخ ممکن است بهطور ناگهانی در خود سیتوپلاسم تشکیل شوند. این رخداد اغلب و نه مطلقا برای سلول مرگآور است. اگر سلولهایی که داخل آنها منجمد شدهاند را خیلی گرم کنیم سلول ممکن است که از آسیب رهایی یابد]۱۰۴[. در مقابل در انجماد شیشهای سلولها، در غلضت بالای محلول ضدیخ سرد میشوند و تحت سرعت انجماد بالا قرار میگیرند که باعث میشود کریستال یخ داخل سلولی تشکیل نشود.
انجماد شیشهای آب اطراف سلول میتواند به دو روش بهدست آید: ۱- افزایش سرعت انجماد ۲- افزایش غلظت ضدیخ که در مجموع با بهره گرفتن از حجم پایین یک محلول حاوی ضدیخ غلیظ، این سرعت انجماد خیلی بالا که از ۱۵۰۰۰ تا ۳۰۰۰۰ درجهسانتیگراد بر دقیقه است،بهدست میآید(^۰C – ۲۵ ^۰C=221⁰C/0.5 sec= 26520 ^۰C/min169-=ΔΤ).
از آنجایی که دو فاکتور خیلی مهم برای انجام انجماد شیشهای موفق سرعت انجماد بالا و غلظت بالای ضدیخ میباشد، بنابراین ایجاد توازن بین به حداکثر رسانیدن سرعت انجماد و به حداقل رسانیدن غلظت ضدیخ، از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. سرعت ایدهال برای انجماد شیشهای سرعتی است که به آب داخل سلولی فرصت خارج شدن به منظور انجماد و یا شیشهای شدن در خارج سلول را میدهد. بنابراین استراتژی اولیه هر پروتکل انجماد شیشهای موفقی باید گذر سریع از دمای بحرانی که بین ۱۵ تا ۵- درجهسانتیگراد است و در آن احتمال ایجاد آسیبهای برودت بالا میرود، باشد. این امر خصوصا زمانی که نمونه حساسیت بالایی دارد نظیر ساختارهای غنی از چربی (مانند جنین خوک)، تخمکها و جنینهای در مرحله قبل از تراکم اهمیت پیدا میکند.
بهمحض فروبردن سلولها در نیتروژن مایع، نیتروژن مایع گرم شده و این امر بهطور پهناوری جوش را القا میکند. در این نقطه تبخیر رخ میدهد و یک پوشش بخار اطراف نمونه شکل میگیرد.در نتیجه بخار اطراف نمونه میتواند عایق موثری ایجاد کند که انتقال دما را کم کرده و در نتیجه سرعت انجماد کاهش مییابد. بنابراین برای بهدست آوردن سرعت انجماد بالاتر، بهتر است که انتقال حرارت از طریق مایع به جای بخار صورت گیرد چرا که انتقال حرارت رسانشی در مایع خیلی سریعتر از بخار است.
سه راه عملی برای افزایش سرعت انجماد و ذوب عبارتنداز:
- کاهش حجم محیط اطراف تخمک و جنین

• • به حداقل رسانیدن عایق سازی حرارتی^[۷۳]

• • ترجیحاٌ تماس مستقیم بین محلول ضدیخ و نیتروژن مایع و اجتناب از تشکیل بخار نیتروژن مایع.

همانطور که گفته شد امکان دیگر بهبود سرعت انجماد و ذوب جلوگیری از تشکیل بخار نیتروژن مایع است. اخیراٌ دو راهحل برای رفع این مسئله مطرح شده است. اولین راهحل امکان فرا سرمادهی نیتروژن مایع است. ایجاد خلاء روی نیتروژن مایع برای مدت زمان کوتاه، دما میتواند تا ۲۰۵- یا ۲۱۰- درجهسانتیگراد و بسیار دور از نقطه جوش کاهش یابد. این امر امکان تشکیل پوشش گازی اطراف نمونه را به حداقل رسانده و متعاقباٌ سرعت انجماد را افزایش میدهد. راه حل دیگر، قرار دادن جنین و یا تخمک بر روی یک صفحه فلزی فراسرما داده شده تا ۱۵۰ درجهسانتیگراد (انجماد شیشهای با بهره گرفتن از سطح جامد) است.
۱-۷-۳-۱-۱-۳- سرعت گرم کردن
سرعت ذوب نیز برای نگهداری سلولهای پستانداران در شرایط انجماد خیلی مهم است. سرعت متوسط ذوب برای یک نوع مشخص سلول کاملاٌ به سرعت متوسط انجماد که سابق بر آن داشته است وابسته است. در ابتدا تحقیقات نشان دادند که گرم کردن سریع سلولهای پستانداران بعد از انجماد همیشه بهتر است چرا که سلولها زمان کوتاهتری برای دوباره کریستاله شدن داشته و کمتر در معرض ضدیخ قرار میگیرند. اما اولین تحقیق بر روی انجماد جنین موش توسط ویتینگهام و همکاران نشان داد که استثنائاتی در این قانون وجود دارد. مطالعه آن‌ها نشان داد که جنین‌هایی که به روش آهسته منجمد می‌شوند زمانی‌که به آهستگی ذوب می‌شوند بقای بعد از ذوب بیشتری خواهند داشت. در حقیقت آن‌ها گزارش دادند که بقای جنین به گرم کردن با سرعت پایین وابسته است. آن‌ها نتیجه گرفتند که میزان بقای ضعیف در اثر سریع گرم کردن احتمالاً به خاطر تأثیرات اسمزی رخ می‌دهد]۱۷۷[.
عمومی‌ترین روش گرم کردن تخمک و جنین‌ها بعد از انجماد شیشه‌ای روش سریع و مستقیم است. معمولاً تخمک و جنین‌ها به محلول ۳۷-۲۰ درجه سانتی‌گراد منتقل می‌شوند. بعد از گرم کردن باید آب‌دهی شده و ضدیخ استفاده شده در امر انجماد شیشه‌ای حذف گردد. این امر باید سریع صورت گیرد اما در مورد رقیق کردن چند مرحله‌ای هنوز بحث وجود دارد.
۱-۷-۳-۱-۱-۴- مواد محافظ انجمادی
زمانی‌که سلول‌های پستانداران در یک محلول رقیق نمکی سرد و منجمد شوند، کاملاً آسیب دیده و از بین می‌روند. با توضیح بالا باید گفت که زنده ماندن اسپرماتوزوئیدهای طیور زمانی‌که در یک محلول حاوی ۱۰ درصد گلیسرول به اضافه آلبومین منجمد شوند، در سال ۱۹۴۹ به صورت کاملاً تصادفی مشخص شد ]۱۲۶[. بعد از آن گوساله حاصل از تلقیح مصنوعی اسپرم منجمد- ذوب شده به دنیا آمد ]۱۵۲،۱۲۵ [. این موارد اولین مطالعات روشنی بود که نشان دادند سلول‌های پستانداران می‌توانند با افزودن یک مکمل به محیط کشت با موفقیت منجمد شوند ]۵۴[.
از اولین کشفیات تا کنون پی بردهاند که تعداد زیادی از ترکیبات با وزن مولکولی پایین، از سلول علیه آسیب انجماد محافظت میکنند. این ترکیبات که امروزه تحت عنوان ضدیخ^[۷۴] نامیده میشوند، همگی با هر نسبتی قابل حل در آب هستند. این ترکیبات همچنین برای سلول نسبتاً غیر سمی بوده و وزن مولکولی پایینی دارند. این افزودنیهای محافظ به محلولهایی که جهت انجماد سلول در نقطه پایینتر از نقطه انجماد استفاده میشوند اضافه میگردند. ضدیخها همچنین با تاثیر بر لیپید موجود در غشای سلولی، این غشا را ارتجاعی میسازند.
۱-۷-۳-۱-۱-۵- نقش ضدیخ ها
ضد یخ‌ها با حضور در محلول‌های انجمادی تأثیرات خود را به اشکال زیر اعمال می‌کنند: