در ادامه مقدار ۱۰۰ میکرومتر از هر یک از این رقت­ها در پلیت­های استریل جداگانه با روش پورپلیت^[۵۵] در محیط SDA^[56] کشت داده شد (ظهوریان، ۱۳۸۹). نحوه­ انجام این روش بدین صورت است که مقدار ۱۰۰ میکرومتراز تمام رقت­ها بطور جداگانه در پلیت استریل ریخته شد و بلافاصله روی آن محیط SDA تازه که قبلاً با اتوکلاو استریل و در دمای اتاق تا حدودی خنک شده، اضافه گشت و درب پلیت­ها گذاشته شد و پلیت به شکل ∞ انگلیسی خوابیده روی سطح صاف میز کاری حرکت داده شد تا به مدت یک دقیقه کاملاً مخلوط گردد. با توجه به اینکه محیط SDA حاوی آگار نیز می­باشد، نبایستی بیش از حد داغ باشد زیرا در این صورت تمام میکرو­ارگانیسم­ها از بین رفته و رشدی مشاهده نخواهد شد. سپس پلیت­های حاوی محیط تا انعقاد کامل رها شد و نهایتاً در دمای ۲۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت انکوبه گشت (ظهوریان، ۱۳۸۹) (شکل ۳-۴ و ۳-۵).
شکل ۳- ۴ کشت به روش پورپلیت
 
شکل ۳- ۵ اشکال متنوع مجموعه کلنی های رشد یافته در محیط SDA با روش کشت پورپلیت
پس از سپری شدن زمان مذکور و رشد کلنی­ها، آنها بر اساس اندازه، شکل حاشیه یا لبه­ی کلنی و تولید رنگیزه (پیگمان) مجدداً در پلیت جداگانه با روش کشت سطحی بر روی محیط SDA کشت داده شدند. در ادامه انکوباسیون در دمای cْ ۲۵ به مدت ۴۸-۲۴ ساعت صورت پذیرفت (ظهوریان، ۱۳۸۹؛ Black , 1999) (شکل ۳-۶).
 
شکل۳- ۶ روش کشت سطحی
۳-۳-۴ ایزوله نمودن کلنی ها در محیط کشت Mycosel Agar
برای ایزوله کردن تک کلنی­ها­ی مخمری از کلنی­های باکتریایی و قارچ­های ساپروفیت، کشت مجددی با همان روش روی محیط Mycosel Agar ( scc) انجام شد. برای تهیه­ این محیط کشت ۳۶ گرم از پودر آماده­ی محیط فوق را در یک لیتر آب دیونیزه حل وPH آن بررسی شد تا مقدار آن ۶٫۹ شود. سپس محلول جوشانده تا شفاف گشت و نهایتاً در دمای ۱۱۸ درجه ی سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو شد. سپس محیط کشت داخل پلیت­های استریل ریخته شد. پس از بسته شدن محیط­های کشت آنها را در دمای ۳۷ درجه به مدت ۲۴ ساعت انکوبه نموده و سپس آماده­ی کشت شدند. در ادامه کشت کلنی­ها به روش کشت سطحی صورت گرفت و در دمای c⁰ ۲۵ به مدت ۴۸-۲۴ ساعت انکوبه گردید (ظهوریان، ۱۳۸۹ ).

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

در نهایت برای اطمینان کامل از مخمر بودن کلنی­های ایزوله شده، از دو روش تشخیص میکروسکوپیک استفاده شد. بدین منظور روش رنگ آمیزی با معرف لاکتوفنول کاتن بلو انجام شد برای انجام این روش یک قطره از معرف مذکور وسط لام شیشه ای ریخته شد و یک کلنی از نمونه بر روی معرف افزوده شد و با آنس استریل مخلوط گشت و در نهایت با قرار دادن لامل روی آن، لام را داخل محفظه­ی مرطوب قرار داده و بررسی میکروسکوپی نمونه انجام گشت (دیبا،۱۳۹۰). در روش دوم لام رنگ­آمیزی گرم تهیه شد (ظهوریان، ۱۳۸۹؛ میرباقری و همکاران۱۳۹۰؛ Deak et al, 2000) و زیر میکروسکوپ شکل سلولی هر کلنی مشاهده شد (شکل ۳-۷).
شکل ۳- ۷ مشاهده میکروسکوپی نمونه­ها
۳-۴ شناسایی مخمرها در محیط­های کشت اختصاصی
بعد از ایزوله سازی به منظور شناسایی جنس مخمرها از دو محیط کشت CHA و CMA استفاده شد.
الف- تهیه محیط کشت CHA (کروم آگار کاندیدا)
طبق دستورالعمل شرکت سازنده ۴۷٫۷ گرم از پودر محیط کشت در یک لیتر آب دیونیزه حل شد و محلول حاصل روی شعله جوشانده و شفاف گردید. این محیط نیازی به اتوکلاو ندارد. بنابراین پس از شفاف شدن در دمای اتاق خنک شد و در پلیت استریل ریخته و پس از بسته شدن محیط­های کشت آنها را در دمای ۳۷ درجه به مدت ۲۴ ساعت انکوبه نموده و سپس آماده­ی کشت شدند.
کشت در محیط CHA با همان روش کشت سطحی انجام شد و پلیت­ها در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه گردیدند؛ بررسی رنگ اختصاصی تولید شده در هر پلیت یک بار۲۴ ساعت پس از کشت اولیه و بار دوم ۴۸ ساعت پس از کشت اولیه صورت گرفت (Paritpoke et all, 2005) (شکل ۳-۸).
شکل ۳- ۸ تنوع رنگ های مشاهده شده بر روی محیط کروموژنیک
محیط کشت CMA ^[۵۷]
با توجه به اینکه محتویات این محیط شامل Corn Meal Extract (2 گرم در لیتر) و آگار (۱۵ گرم در لیتر) می­باشد بنابراین طبق دستورالعمل روی بطری محیط کشت، مقدار ۱۷ گرم از پودر محیط کشت در یک لیتر آب دیونیزه حل و روی شعله جوشانده و شفاف شد و در دمای ۱۲۱ درجه­ سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گشت تا استریل شود. پس از بسته شدن محیط­های کشت آنها را در دمای ۳۷ درجه به مدت ۲۴ ساعت انکوبه نموده و سپس آماده­ی کشت شدند (Kelly&Funigiello, 1959 ).
کشت در محیط کشت CMA با روش Dalmau methodانجام شد، بدین صورت که در نوک آنس مقدار کمی از کلنی مخمر به صورت دو خط موازی نزدیک به هم داخل آگار تلقیح شد؛ عمق شیارها باید به قدری باشد که آگار پاره نشود، در نهایت لامل استریلی روی خطوط تلقیحی قرار داده شد. سپس در دمای ۲۸ تا ۳۰ درجه ی سانتی ­گراد به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت انکوبه شدند (larone , 1939) (شکل ۳-۹ و شکل ۳-۱۰).
شکل ۳- ۹ نحوه ی کشت در محیط CMA
  
شکل ۳- ۱۰ تنوع سودوهایف های مشاهده شده بر روی محیط CMA
با توجه به اینکه ظاهر میکروسکوپی بسیاری از مخمرها بر روی محیط کشت CMAاختصاصی بوده و ممکن است آن دسته از مخمرهایی را که اختصاصات بیوشیمیایی مشابهی دارند را از هم تفکیک کنند بنابراین جنس­های مخمری با اطمینان از هم تفکیک شدند ( دیبا،۱۳۹۰). سپس با بهره گرفتن از روش­های مولکولار به طور دقیق­تر جنس و گونه­ و سویه­ی مخمرها شناسایی گردید.

کشت­کلنی­های مخمر در محیط کشت مایع غنی سازی مخمر
برای تکثیر مخمر از محیط کشت غنی سازی مخمر استفاده شد. این محیط کشت به صورت مایع بوده و برای تهیه ی ۹۰ میلی لیتر از آن، مواد به مقادیر زیر استفاده شد: آب دیونیزه شده ۹۰ میلی لیتر، گلوکز ۵ درصد ۵/۴ گرم، عصاره مخمر^[۵۸] ۸/۱ گرم، K2HPO4 9/0 گرم. برای تهیه­ این محیط ابتدا در یک ارلن به میزان ۹۵۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر (دیونیزه) اضافه گردید و مواد نامبرده بجز گلوکز به آن اضافه شد، PH بررسی گشت تا میزان آن برابر ۶ شود (با بهره گرفتن از استیک اسید یا NaOH به رنج ذکر شده رسید) سپس به مدت ۱۵ دقیقه در دمایc ْ ۱۲۱ در اتوکلاو قرار گرفت تا استریل شود، سپس ۴٫۵ گرم گلوکز را در ۵۰ میلی لیتر آب مقطر حل و با فیلتر در کنار شعله داخل محیط استریل اضافه شد و در داخل لوله­های آزمایش استریل ۲۰ میلی لیتر از محیط ریخته شد؛ سپس ۱گرم از مخمر به آن اضافه شده و به مدت ۴۸ ساعت در دمای c ° ۲۶در انکوباتور شیکر دار قرار گرفتند. (Aoki et al, 2002) (شکل ۳-۱۱).
شکل ۳- ۱۱ قرارگیری نمونه های مخمری تلقیحی به محیط کشت مایع غنی سازی مخمر داخل انکوباتور شیکردار
بعد از مدت گذرانده شده در دور ۳۵۰۰ rpm و مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شدند و محلول رویی دور ریخته شد و روی رسوب باقی مانده سرم فیزیولوژی ریخته شد و این مراحل چندین مرتبه تکرار گشت تا رنگ محلول پس از سانتریفیوژ بی­رنگ شود. مخمر باقی مانده با سرم فیزیولوژی شستشو داده شده و تا زمان مصرف در دمای c⁰ ۲۰- نگهداری شد (Aoki et al, 2002) (شکل ۳-۱۲).